猪蓝耳致病NADC-30S荧光PCR双重检测试剂盒说明书

【产品名称】

商品名称：病猪蓝耳高致病/NADC-30S?核酸检测试剂盒（实时荧光-PCR 法）

英 文 名 ：A highly pathogenic /NADC-30S nucleic acid detection kit for blue ear of sick pigs (real-time fluorescence -PCR)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

病猪蓝耳高致病/NADC-30S?由A型流感病毒引起禽类的一种从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的传染病[1]。其中病猪蓝耳高致病/NADC-30S?，不仅可以感染禽类，也可以感染人类，特别是1999年以来，严重威胁了人类健康、畜牧业生产和畜产品的贸易，其公共卫生意义已引起*的广泛关注[4]。本试剂盒利用实时荧光PCR原理，定性、定量检测禽流感病毒H9亚型，对病猪蓝耳高致病/NADC-30S?引起的流感诊断有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对病猪蓝耳高致病/NADC-30S?基因高度保守区域设计特异性引物和探针， 在反应体系中含病猪蓝耳高致病/NADC-30S?基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测    结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

名 称 规 格

酶液 50μL×1 管

反应液 1.0mL×1 管

阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理盐水中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1.2RNA 提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye） FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、

stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且明显的扩增曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现明显曲线的样本建议重复试验，重复试验结果如果同样出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线则为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6.质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【参考文献】

[1]WEBSTER R G, BEAN W J, GORMA N O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses [J] . Microbiol Rev, 1992, 56(1): 152 -179.

[2]GUO Y J, KRAUSS S, SENNE D A, et al. Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia

[J] .Virology, 2000, 267( 2):279 -288.

[3]唐秀英, 付朝阳, 冯菊艳. H9 亚型禽流感的流行不防制[J] . 预防兽医学进展, 2000, 2( 4): 1-3.

[4]郭元吉, 李建国, 程小雯, 等. 禽 H9N2 亚型流感病毒能感染人的发现[J] . 中华实验和临床病毒学杂志, 1999, 13( 2): 105-108.

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